专性与非专性有机卤化呼吸细菌在有机卤化物的地球化学循环及环境修复过程中发挥核心作用，然而它们之间的相互作用关系缺乏研究。针对这一科学问题，中山大学环境科学与工程学院的汪善全团队于2021年在ISME Communications上发表了题为“Substrate-dependent competition and cooperation relationships between Geobacter and Dehalococcoides for their organohalide respiration”的研究论文。
受长江流域环境水科学研究公众号邀请，中国地质大学（武汉）袁松虎教授课题组博士生蔡其正对本文进行了解读。
第一部分：内容解读
摘要：专性及非专性有机卤化呼吸细菌（脱卤菌，OHRB）在有机卤化物的地球化学循环及环境生物修复过程中发挥着核心作用。它们的共存及相互作用可能产生功能冗余并有助于群落稳定，进而确保有机卤化呼吸效率，然而也使得特定脱卤菌的分离和鉴定更具难度。本文利用了细胞的生长速率/产量平衡理论，从一个以专性脱卤菌Dehalococcoides（Dhc）为主的群落中，富集并分离得到了一株罕见的非专性PCE降解菌Geobacter（Geo），为群落中的生长速率/产量平衡理论提供了实验证据。进一步的细菌表征、基因组特征分析以及共培养实验揭示了PCE与PCBs脱氯过程中，Dhc与Geo之间三种独特的相互作用关系（自由竞争、条件竞争及互营共生）。其相互关系取决于电子供体（乙酸盐/H2 vs. 丙酸盐）以及电子受体（PCE vs. PCBs）的不同。本工作是首个揭示了底物依赖性专性/非专性脱卤菌相互作用关系的研究，同时提供了从环境中分离生长条件苛刻的微生物的新方法，并为有机卤化物的地球化学循环和环境生物修复提供了新见解。
研究背景：在自然环境中，有机卤化物可以通过生物体、生物燃烧、火山活动及其他地热活动形成，是卤素生物地球化学循环不可或缺的一部分。其中，由人为处理不当导致的有机卤化物（如PCE和PCBs）的自然泄漏及通过食物网造成的生物积累对公共卫生及生态系统功能产生了不良影响。在长期自然选择及进化下，多种细菌能够通过有机卤化物呼吸获得细胞生长的能量，并进一步被划分为只能以有机卤化物为终端电子受体的专性脱卤菌和呼吸方式更广泛的非专性脱卤菌。两种类型的脱卤菌可能共存于一个群落中，竞争作为呼吸电子受体的有机卤化物。然而由于培养条件苛刻且相互作用复杂，从群落中分离特定脱卤菌极其困难。因此，需要深入了解两种脱卤菌之间的相互作用关系及其特性，以更好地对它们进行分离、表征和应用。与专性脱卤菌相比，非专性脱卤菌生长更快，但细胞产量更低。根据特定种群的生长速率/产量平衡理论，长时间的培养可能更有利于生长速率缓慢但产量更高的物种（如Dhc），相比之下非专性脱卤菌的生长在早期培养阶段是更有利的。该理论可能有助于将特定的细菌从复杂的群落中分离出来。
与此同时，微生物群落中，专性脱卤菌与其他细菌（尤其非专性脱卤菌）之间会形成营养代谢网络，这与底物利用关系密切，而该过程会进一步调节微生物群落组成和功能（如专性脱卤菌、非专性脱卤菌与其他微生物之间的关系）。然而目前没有关于脱卤菌与非脱卤菌相互关系的研究。同时，相关信息的缺失可能会导致脱卤菌原位脱卤活性的无法预测性，进一步导致卤代污染生物修复的失败。因此，作者根据生长速率/产量平衡理论，从Dhc为主的PCB/PCE脱氯群落中分离了一株PCE脱氯菌Geo，并进一步通过细胞表征、基因组特征分析及共培养实验研究了它们之间的底物依赖性相互作用关系。
方法部分：
作者首先利用常规厌氧培养方式在PCE/PCB污染沉积物中富集脱氯菌，在5次转培获得稳定脱氯效果后，为了富集生长更快的Geo，将培养时间从8天缩短至3天，并将碳源和电子供体从乳酸改为乙酸/H2转培8次。随后加入氨卡青霉素（Geo对其具有耐性）以抑制Dhc生长。
分离过程：将培养液进行多次稀释，并补充电子供体、PCE与氨卡青霉素，同时检测PCE的脱氯活性。在多轮（17次）稀释后获得了能将PCE脱氯至cis-DCE的培养液，并通过扫描电镜（SEM）与基因组测序确认产物纯度，获得了纯菌株Geobacter lovleyi LYY。
为探究两种菌之间的相互作用关系，开展了Dhc、Geo的纯培养及共培养实验，并比较了不同电子供体存在下的差异。
结果部分（假说论证）：
首先对脱氯培养物中的PCB/PCE降解趋势和相对应的Dhc、Geo菌丰度变化进行了测试，发现专性脱卤菌菌Dhc初始丰度更高（68.87%），但生长缓慢，而非专性脱卤菌菌初始丰度很低（0.35%），但具有更高的细胞产率。符合生长速率/产量平衡理论的是，在低细胞浓度和高底物（PCE）浓度条件下，Geo生长迅速，而随着脱氯降解的发生，PCE浓度逐渐降低，高细胞浓度的Dhc生长逐渐占据优势（图1）。由此可见，缩短培养时间可能利于Geobacter的富集。因此，作者将培养时间从8天缩短至3天，并持续以较短的转移时间培养，使得Dhc逐渐从群落中被淘汰，最终富集到了以Geo为优势种的微生物群落。
进一步对Geo进行分离。通过连续稀释法，并在培养基中加入氨苄青霉素（Geo耐但Dhc不耐）以逐步降低Dhc丰度、纯化Geo，最终成功分离出一株Geobacter lovleyi LYY，并经SEM和基因组分析鉴定为纯菌（图S3）。随后进行了该菌株基因组草图的组装，发现LYY菌株有一个单一的全长rdhA基因，与G. lovleyi SZ菌株的pceA基因有99%的氨基酸序列相似性，这验证了LYY菌株的脱氯活性。进一步分析丙酸盐和氢的基因组编码途径发现，在没有可利用的乙酸盐和氢的情况下，LYY菌株可以利用环境中的碳源和电子供体以供Dhc呼吸（图2）。另外，根据基因编码的代谢潜力，发现LYY菌株可能与Dhc竞争PCE→DCE脱卤酶，但其通过产生cis-DCE，又可以支持Dhc的DCE→乙烯代谢途径。并且Geo可能为Dhc等提供钴胺素来源，虽然其不具备完整的合成钴胺素能力。这些结果表明，这两种菌之间不仅可能存在竞争关系，还具有合作关系。
进一步在共培养体系中探究了Geo和Dhc之间的相互作用关系。实验分为两组：（1）以丙酸盐为电子供体，PCE为污染物的Geo-Dhc共培养脱氯体系；（2）以丙酸盐为电子供体，PCB180为污染物的Geo-Dhc共培养脱氯体系。并设置乙酸盐/H2为碳源/电子供体、纯Geo和Dhc分别为培养对象的PCE脱氯对照组。结果显示，在第一组实验（丙酸盐为电子供体）中，Geo与Dhc共同生长，但Geo的生长在PCE脱氯过程中占优势（图3A-3C）。Geo从PCE脱氯和丙酸盐→乙酸盐/H2代谢中获得能量，而低脱氯效率（Dhc本身脱氯性质决定）和利用Geo代谢产物（而非直接供给的）作为碳源/电子供体使得Dhc在共培养中失去竞争优势（图3D）。因此，第一组实验中Geo和Dhc同时具有竞争及合作关系。在乙酸盐/H2为电子供体的对照组中，由于没有“Geo消耗丙酸盐为Dhc提供碳源/电子供体”这一路径，因此两种菌处于竞争关系。而第二组实验中，仅在Geo-Dhc共同体系中观察到了PCB180的脱氯，其中仅Dhc生长趋势与PCB180的还原降解趋势相耦合（图3E、3F）。该过程中，Geo转化丙酸盐为乙酸盐/H2为Dhc提供碳源与电子供体，支持其脱氯，而Dhc对乙酸盐/H2的消耗使得Geo进一步代谢丙酸盐（图3H）。因此，第二组实验中Geo和Dhc具有互营共生的关系。
讨论部分（成果意义）：
本研究首先通过生长速率/产量平衡原理成功实现了多脱卤菌共存的混菌体系下，特定脱卤菌的分离。由于脱卤菌生长条件的苛刻性，该过程在过去被认为是极其困难的。因此，本研究的成果为富集分离特定微生物提供了一个新的途径。此外，以往对于脱卤菌的研究往往聚焦在它们的竞争关系上，而本研究首次报道了新的脱氯菌（Geo-Dhc）之间的竞争-合作机制：（1）自由竞争；（2）条件竞争；（3）互营共生（图4）。由于Geo在环境中的普遍存在性及功能多样性，其在自然环境中与其他物种的互相作用关系可能更为广泛，也值得去探究。由于自然环境中代谢底物的多样性，更多机制有待探究。而该研究中基于微生物培养的数据与基因组数据也显示出了Geo-Dhc之间具有（除实验结果之外的）相互作用机制，也值得运用其他基因组学分析手段进行探究。
第二部分：贡献解读
背景问题：有机卤化物的生物转化过程极大影响卤素的地球化学循环和卤代物的生物修复，其中脱卤菌发挥核心作用。环境中多种脱卤菌常常同时存在，共同影响有机卤化物的生物转化，但由于生长条件苛刻，且不同脱卤菌相互作用复杂，特定的脱卤菌很难从混合菌群中被分离出来。本文作者从微生物生长速率/产量平衡理论获得了灵感，尝试将非专性脱卤菌从与专性脱卤菌共存的体系中分离出来（问题1），并进一步探究了两者之间的相互作用关系（问题2）。
核心发现： 基于微生物的生长速率/产量平衡理论发明了一种用于从混菌体系中分离特定细菌的方法，该方法可以从群落中具有复杂相互作用关系的微生物（如非专性-专性脱卤菌，既能同时降解卤代物，但代谢和生长性质又有差异）之间分离出特定细菌。该发现促成了进一步的实验设计，作者从中发现了在不同的营养条件下，专性-非专性脱卤菌之间存在完全竞争、互营共生以及竞争/共生同时存在的相互作用关系，拓展了对专性-非专性脱氯菌相互作用关系的认识，并进一步抛出了更多值得研究的问题。
原文来源：Liang., et al., Substrate-dependent competition and cooperation relationships between Geobacter and Dehalococcoides for their organohalide respiration, ISME Communications., 2021, https://doi.org/10.1038/s43705-021-00025-z.
本文由中国地质大学（武汉）生物地质与环境地质国家重点实验室袁松虎教授课题组博士生蔡其正解读。受作者能力所限，本文难免有不当之处，敬请各位读者谅解。如疑义、建议或其他方面的学术交流，请与袁松虎教授联系，邮箱yuansonghu622@cug.edu.cn.
