第一作者：陈君（中国地质大学（武汉））
通讯作者：张伟军 研究员（中国地质大学（武汉））
论文DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.157157
成果简介
近日，中国地质大学（武汉）张伟军研究员在环境领域期刊《Science of the Total Environment》上发表了题为“The molecular characteristics of DOMs derived from bio-stabilized wastewater activated sludge and its effect on alleviating Cd-stress in rice seedlings (Oryza sativa L.)”的论文。本文以污泥生物稳定化产物（好氧堆肥、厌氧消化）中的溶解性有机质为研究对象，借助光谱学表征手段与高分辨率质谱分析方法，对污泥稳定化产物中溶解性有机质（DOM）的基本性质、分子组成进行深入解析，同时探究两种溶解性有机质与重金属镉的互作机制。然后，以水稻为模式生物，研究污泥稳定化产物中溶解性有机质存在下，Cd对水稻幼苗的生理生化变化和基因转录表达的影响，从而揭示污泥生物稳定化产物中溶解性有机质对植物Cd毒性的削减机制。
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天然有机质广泛参与了地球生物化学循环过程，土壤有机质可以促进植物生长，降低重金属的生物毒性。市政污泥有机质含量高，通过土地利用可以提高土壤有机质含量。本研究以污泥生物稳定化产物中的溶解性有机质为研究对象，首先借助光谱学表征手段与高分辨率质谱分析方法，对好氧堆肥DOM与厌氧消化DOM的基本性质与分子组成进行了深入解析，在对性质了解的基础上，探究了两种DOM与重金属Cd之间的作用机制，然后以水稻作为生物效应研究对象，通过对水稻幼苗的生理生化分析和基因转录表达研究，探析了污泥生物稳定化溶解性有机质在植物重金属毒性效应方面的影响机制。研究结果表明，不同污泥生物稳定化产物溶解性有机质分子组成存在显著差异，其中好氧堆肥溶解性有机质主要以低芳香性、高疏水性的小分子有机质组成，而厌氧消化溶解性有机质的分子量大，不饱和度高、疏水性低。好氧堆肥溶解性有机质以富含羧基的CHO类物质为主，厌氧消化溶解性有机质以CHON类的类蛋白物质或CRAM类物质组成。在与镉的作用机制方面，好氧堆肥溶解性有机质与Cd主要以静电力的方式结合，倾向于形成低配比的不稳定络合物，作用前后络合物的水动力直径几乎不变；而厌氧消化溶解性有机质与Cd之间则易形成大粒径的稳定络合物，作用前后络合物的水动力直径显著增加。两种污泥生物稳定化DOM均可以缓解水稻的镉胁迫，使水稻幼苗生长得以恢复，污泥生物稳定化溶解性有机质可以通过增强水稻幼苗根系核酸代谢过程来帮助水稻幼苗抵御重金属Cd胁迫。
引言
近年来，污泥的土地利用及其生态环境效应在国内外已受到广泛关注。污泥富含有机质，是天然的有机肥料。当其土地利用后，可为土壤提供丰富的营养物质。在污泥土地利用前，通常需要对污泥进行生物稳定化处理，如好氧堆肥、厌氧消化等。经生物稳定化后的污泥中有机质种类众多，其主要以水溶态与非水溶态两种形式存在，其中，能透过0.45μm滤膜的有机质被称为溶解性有机质（Dissolved organic matter, DOM）。溶解性有机质是污泥土地利用过程中，是影响土壤性质，植物生长最直接的部分，生物活性强，具有重要意义。
不同生物稳定化方式产生的DOM分子组成不同，其生态环境效应则不同。DOM作为有机质中最为活跃的组分，包含多种类型的活性官能团，如羟基、羧基、羰基、氨基等，这些官能团能与多种重金属络合,进而改变重金属的活性,影响重金属的迁移转化。因此对于污泥生物稳定化产物中DOM对重金属的植物毒性效性尚待研究。
图文导读
一、DOM的分子组成差异
研究发现，污泥生物稳定化方式均可以产生大量的溶解性有机质，且重金属含量低，能在土地利用过程中为土壤提供丰富的有机质。借助高分辨率质谱与常规光谱学表征方法相结合对两种生物稳定化产物的DOM分子组成进行表征，研究发现好氧堆肥产生的溶解性有机质主要由芳香性低，疏水性强的小分子量CHO类物质组成，有机酸和有机酯含量较高，且富含羧基，而厌氧消化产生的溶解性有机质则主要由不饱和度高，疏水性弱的大分子量的CHON类物质组成，多为CRAMs、类脂类物质。
在与镉的相互作用过程中，好氧堆肥产生的溶解性有机质易于与镉通过静电力方式结合，形成低配比的小分子络合物，稳定性差，而厌氧消化产生的溶解性有机质能与镉之间形成稳定性较好的大分子络合物。
图1. 两种污泥生物稳定化产物中溶解性有机质的分子组成
二、污泥生物稳定化产物中DOM对植物镉毒性的影响
首先，就生物量而言，研究发现，当添加重金属Cd后，水稻生长受到了明显的抑制，根系作为直接接触重金属Cd的植物部位，抑制作用明显，在DOM与Cd同时添加时，水稻的生物量相较仅添加Cd的实验组出现了显著增加，具体表现为根系变长，叶片面积增加，地上部与根系的生物量均显著增加。
其次，对于水稻幼苗对镉的吸收转运而言，研究发现，相较于地上部分，重金属Cd主要富集在水稻幼苗根系，而当添加污泥生物稳定化溶解性有机质后，水稻幼苗对Cd的吸收出现了一定程度上的变化，其中在Cd胁迫下，当好氧堆肥DOM添加后，促进了水稻幼苗对Cd的吸收，而厌氧消化DOM添加后，减少了水稻幼苗对Cd的吸收。结合对两种污泥生物稳定化溶解性有机质与Cd作用机制分析发现，好氧堆肥DOM的分子量小，水动力粒径小，其通过静电作用与Cd形成了不稳定的络合物。在水培体系中，自由态镉是水稻幼苗根系吸收的主要部分，在植物根系周围，随着自由态镉的吸收，会导致Cd与好氧堆肥DOM形成的不稳定络合物的解离，从而导致水稻幼苗镉含量的增加。与此同时，由于镉与好氧堆肥DOM络合后络合物大小维持小粒径形态（水动力直径由320nm增加到324nm），因此可能也存在部分镉以好氧堆肥DOM与Cd的络合物形式进入植物体内。而厌氧消化DOM的分子量大，与Cd络合后生成了大粒径的稳定络合物，因此不易被水稻幼苗吸收，且不易解离。对于转运系数而言，在非超富集植物中，重金属镉的迁移率一般较低。本研究中，两种污泥生物稳定化溶解性有机质均提高了水稻幼苗根系中的镉向地上部分转运的能力。这是由于重金属能抑制植物的光合作用和蒸腾作用，从而影响重金属的转运，而两种污泥生物稳定化有机质的存在缓解了植物毒性，促进了水稻幼苗的生长，同时增强了重金属从根系向地上部的迁移，从而导致转运系数的增加。
图2. 水稻幼苗的生长情况变化与镉的吸收转运情况变化
此外，对水稻幼苗根系的氧化应激系统进行表征发现，Cd会造成植物根系细胞产生大量的活性氧，当添加污泥生物稳定化溶解性有机质后，细胞内活性氧水平明显下降。在本研究中，水稻幼苗根系中MDA含量在Cd胁迫下明显增加，与ROS变化相吻合。在Cd胁迫下，当添加污泥生物稳定化溶解性有机质后，水稻幼苗根系MDA含量下降，说明了污泥生物稳定化溶解性有机质的存在使得水稻根系的氧化胁迫得到了一定的缓解。
水稻根系关键抗氧化酶活性的变化与根系ROS、MDA含量变化相似，当水稻受到Cd胁迫后，植物体内会产生氧化胁迫，导致大量活性氧的生成，随之植物体内会产生更多的抗氧化酶以协助清除过量的ROS。研究发现，在水稻幼苗处于Cd胁迫时，幼苗根系的SOD酶、POD酶、CAT酶活性增强，这表明了水稻幼苗根系中过量ROS的生成，然而当添加污泥生物稳定化有机质添加后，水稻幼苗根系内的抗氧酶活性下降，这是因为污泥生物稳定化DOM的存在缓解了重金属Cd产生的氧化胁迫。当仅添加污泥生物稳定化有机质时，可以观察到水稻幼苗根系中抗氧酶活性的降低，尤其以好氧堆肥DOM实验组最为明显。
图3. 水稻幼苗根系丙二醛和关键抗氧酶活性变化
三、污泥生物稳定化产物中DOM对植物镉毒性影响的分子机制
为深入了解污泥生物稳定化产物中溶解性有机质对水稻幼苗Cd胁迫的影响机制，本研究对空白处理组、镉胁迫处理组、好氧堆肥DOM+镉处理组、厌氧消化DOM+Cd处理组的水稻幼苗根系转录水平进行分析。
研究发现，Cd对水稻幼苗的正常生长会产生明显抑制，而污泥生物稳定化溶解性有机质的添加可以缓解Cd对水稻幼苗的胁迫，使生物量增加，恢复其生长。好氧堆肥DOM由于分子量低，粒径小，易与Cd形成不稳定的络合物而促进水稻幼苗对Cd的吸收，而厌氧消化DOM则由于分子量大，与Cd形成了稳定的大粒径络合物而减少了水稻幼苗对Cd的吸收，然而好氧堆肥促进吸收的Cd可能是以有络合物的形式进入，并未产生额外的重金属毒性。在生理生化方面，Cd胁迫导致大量的ROS的生成，伴随着抗氧化酶活性上升和MDA含量的增加，大量的ROS可损伤细胞膜，导致总离子渗漏率增加与大量细胞的凋亡，而两种溶解性有机质添加后，由于溶解性有机质中的羧基等官能团的存在可作为ROS的清除剂，因此减少了细胞内ROS含量，使得细胞内抗氧酶活性恢复正常，MDA含量减少，总离子渗漏率下降，细胞凋亡情况好转。在分子机制上，两种污泥生物稳定化溶解性有机质可以使Cd胁迫显著改变的激素信号转导代谢通路、谷胱甘肽相关代谢通路与苯丙素的生物合成代谢通路恢复正常。除此之外，两种污泥生物稳定化溶解性有机质均能显著增强水稻幼苗根系核酸代谢，来抵御Cd胁迫。在此基础上，好氧堆肥DOM能显著增强水稻幼苗根系的氨基酸代谢来提高水稻幼苗对重金属Cd的胁迫，厌氧消化DOM则可以通过增强细胞内的碱基切除修复能力还帮助水稻幼苗抵御Cd胁迫。
图4. 水稻幼苗根系GO和KEGG代谢通路富集分析
结论和展望
本研究以污泥生物稳定化产物中的溶解性有机质为研究对象，首先借助光谱学表征手段与高分辨率质谱分析方法，对好氧堆肥DOM与厌氧消化DOM的基本性质与分子组成进行了解析，然后以水稻作为生物效应研究对象，通过对水稻幼苗的生理生化分析和基因转录表达研究，探析了污泥生物稳定化溶解性有机质在植物重金属毒性效应方面的影响机制。主要结论如下：
（1）污泥生物稳定化方式均能产生大量的溶解性有机质，且重金属含量小于国家土壤二级标准（GB15618-2018）和国家农田灌溉水质标准（GB 5084—2021），因此可以作为一种潜在的生态肥料；
（2）好氧堆肥DOM与厌氧消化DOM的性质存在差异，好氧堆肥DOM主要以低芳香性、高疏水性的小分子有机质组成，而厌氧消化DOM的分子量大，不饱和度高、疏水性低；在分子组成上，好氧堆肥DOM以富含羧基的CHO类物质为主，厌氧消化DOM以CHON类的类蛋白或CRAM类物质组成；
（3）重金属Cd能显著抑制水稻幼苗的正常生长，污泥生物稳定化溶解性有机质的添加可以有效缓解胁迫，使水稻幼苗生物量增加，恢复水稻幼苗的生长；
（4）污泥生物稳定化溶解性有机质可以通过增强水稻幼苗根系核酸代谢过程来帮助水稻幼苗抵御重金属Cd胁迫；除此之外，好氧堆肥DOM还可以通过增强水稻幼苗根系的氨基酸代谢过程，协助水稻幼苗抵御Cd胁迫，而厌氧消化DOM可以通过增强幼苗根系细胞中碱基切除修复功能来帮助水稻幼苗抵御Cd胁迫。
作者介绍
通讯作者：张伟军，工学博士，研究员，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者。主要从事有机固废处理与资源化、污废水深度处理与资源化、湖泊沉积物污染控制等方面的研究工作；先后主持国家优秀青年科学基金（2021年）、国家自然科学基金面上项目、国家水体污染控制重大专项子课题、湖北省自然科学基金等项目10余项，参与国家自然科学基金重点项目1项；以第一和通讯作者身份，总计发表论文100余篇，其中在Water Research、Environment International、Environmental Science: Nano等期刊发表SCI论文70余篇（Water Research 16篇），SCI总计他引2000余次。申请国家发明专利14项，授权7项；获2021年华夏建设科学技术一等奖（排名第二）、2015年中国中化集团科技进步二等奖（排名第三）、2020年中国产学研合作创新成果二等奖（排名第二）等奖励。
第一作者：陈君，硕士研究生，中国地质大学（武汉），主要从事有机固废处理与资源化研究，以第一作者身份发表SCI论文两篇。
参考文献：Chen, J., Li, K., Hu, A., Fu, Q., He, H., Wang, D., Shi, J., Zhang, W., The mechanisms of DOMs derived from bio-stabilized wastewater activated sludge alleviate the adverse effects of Cd-stress in rice seedlings (Oryza sativa L.). Science of The Total Environment, 2022, 845, 157157.
文章链接: http://dx.doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.157157
