微生物在河流-地下水交互界面促进反硝化过程的发生，而在反应运输过程中与微生物相关的转录本和酶是否能直接与反硝化速率相关联。针对此关键问题，德国图宾根大学Störiko A.等研究人员于2022年在Water Resources Research上发表题为“Denitrification-Driven Transcription and Enzyme Production at the River-Groundwater Interface: Insights From Reactive-Transport Modeling”研究论文。
受长江流域环境水科学研究公众号邀请，中国地质大学（武汉）袁松虎教授课题组硕士生方文对本文进行了解读。
第一部分：内容解读
摘要：分子生物学工具可以检测环境样品中存在多少与微生物反应相关的酶、功能基因和基因转录物。尽管这些测量包含了关于细菌数量和活性的有价值信息，但它们并不能直接关联硝酸盐等污染物消失的速度。在本文中，研究者使用计算模型模拟富硝酸盐地下水与附近河流相互作用时反硝化、细菌、转录物和酶的耦合动力学。模拟结果得出反硝化速率与分子生物学变量之间存在复杂和非均匀关系，研究发现功能基因转录物对环境条件的每日波动做出响应，然而酶浓度和基因在这种时间尺度上是稳定的。因此得出结论，高水平的功能基因转录物提供了反应区的良好定性指标，但硝酸盐周转的定量预测需要对反应化合物、基因和转录物进行高分辨率测量。
研究背景：在大多数自然环境中，测量分子生物学或组学标记物比测量反应速率变得更直接。这些方法有助于识别特定地点的相关反应过程和反应区的位置，并被誉为反应速率的代表。然而，将分子生物学测量与营养物或污染物的周转率定量关联仍然是一个挑战，并且将其作为速率代理的假设的有效性仍然存在疑问。由于分子生物学分析的高分析成本，迄今为止几乎不存在对基因、转录物或酶浓度的高度空间和时间分辨的测量。基于过程的建模提供了一个有用的工具，用于在稀疏分子生物学测量和其他高分辨率物理和化学参数之间架起桥梁，以帮助验证我们对系统生物、地球化学和物理功能的概念理解，以及与管理相关的尺度。同时，这些模型还可以阐明转录物和酶浓度如何与反应速率相关，以及不同因素如何影响这种关系。微生物氮循环为开发整合分子生物学数据的新建模方法提供了一个理想的测试案例，因为催化相关反应步骤的酶和编码它们的基因是相对已知的。在环境应用中，反应总是与运输耦合。因此，需要对反应和运输的耦合效应进行综合分析，以正确评估分子生物学数据在更复杂环境中的适用性。地表水和地下水之间的界面是研究反硝化及其与迁移相互作用的一个好例子。本文研究者开发了反硝化反应性转运模型，同时预测功能基因转录物、酶和反应速率的分布。应用该模型评估了河流-地下水界面的转录物和酶对稳定和动态水文地球化学状态的响应。
方法部分：
1 模型场景：
图1. 三种模拟场景和相应边界条件的示意图
本文建立了三个通用模型情景，代表河流-地下水界面的不同水文条件（图1），从稳态水文和生物地球化学到明显的日循环。第一种情景模拟了恒定的地下水补给，含水层中富含硝酸盐的水排入河流（图1a）。第二种情况模拟了有氧河水连续进入含水层（图1b），表示河岸过滤情况。第三种情况模拟河岸蓄水，考虑了由动态水位波动引起的水流逆转，反映了水力峰值或潮汐影响（图1c）。在所有情况下都考虑了微生物有氧呼吸和反硝化。这两种途径都与溶解有机碳（DOC）的氧化耦合，溶解有机碳通过含水层基质中的颗粒有机碳（POC）水解释放，并存在于流入的河水中。
2 控制方程：
（1）平流扩散反应输运
通过一维平流扩散反应方程描述了溶解化合物（硝酸盐、亚硝酸盐、氧、DOC）的传输和反应。
其中v平均线流速，D是分散系数，rinet是化合物的净反应速率。
（2）微生物反应
使用了基于酶的微生物反硝化模型公式，该公式通过明确模拟转录因子、功能基因转录物和酶的浓度来反映反应速率的生物调节。
反硝化速率是酶浓度、限制电子供体（DOC）和电子受体（硝酸盐、亚硝酸盐）浓度的双米氏项和氧抑制项的函数：
kjmax是酶（NAR或NIR）每次可最大翻转的底物量（也称为翻转数），Ej是催化底物N（硝酸盐或亚硝酸盐）反应的酶j的浓度。KN和KOC 分别是硝酸盐/亚硝酸盐和DOC的半饱和浓度，IjO2是酶j的氧抑制常数。
有氧呼吸由标准双米氏公式描述，具有最大细胞特异性呼吸速率VO2max和生物量浓度B。
（3）边界条件
固定浓度边界条件适用于河流和地下水流入边界，在氧气水平波动的河岸过滤情况下，河流中的氧气浓度由振幅正弦函数描述
（4）数值方法
使用以单元为中心的有限体积法在空间中离散反应输运方程，所产生的常微分方程（ODE）系统使用后向微分公式（BDF）求解，所有代码都是用Python 3.8编写的，使用包含CVODES的Sunode包用于求解ODE。模型一直运行到达到稳态（在具有恒定边界条件的情况下）或动态稳态（即在具有周期性边界条件的情形下的自重复时间周期）。
结果与讨论：作者展示了三种模型情景导致氮物种、转录物、酶、生物量、氧和DOC的不同空间分布与它们之间的关联。
图2. 不同情景下氮化合物（a）、转录物（b）和酶（c）浓度、生物量（d）、氧（e）和溶解有机碳（DOC）（f）的空间分布。
地下水补给场景中，硝酸盐和亚硝酸盐消耗区与narG和nirS转录物、NAR和NIR酶的绝对浓度升高一致。河岸过滤场景中，河水中的氧浓度分为周期性和恒定，氧气浓度波动导致各类物质浓度不会达到稳定状态，但浓度时间序列会收敛到重复的日循环，生物质浓度随时间变化非常稳定，在存在硝酸盐的区域，narG基因的转录物丰富，nirS转录物与亚硝酸盐共同出现。河岸蓄水场景中，含水层和河流交替流入的硝酸盐导致形成两个不同的反硝化区。
图3. 不同情景下功能基因转录物narG（上）和nirS（下）浓度与反硝化速率之间的关系
基于模拟结果，本文计算了脱氮率，以探索转录物和酶浓度如何与不同场景中的脱氮活性相关。在浓度未达到恒定稳态值但呈现重复的日周期的情况下，显示了速率和浓度的日平均值。颜色表示空间坐标，深蓝色对应地下水流入边界，浅绿色对应河流边界。
在地下水补给场景，系统达到稳定状态，其中酶浓度与转录物浓度成正比。因此，可以分析反应速率与转录物或酶之间的关系。速率和转录之间的关系是非线性的，在域的某些部分相关为正，而在其他部分为负或零。恒定氧输入的河岸过滤场景（图3e和3f）的稳态转录物浓度和脱氮率之间的关系与周期性氧浓度的河岸过滤场景（图3c和3d）略有不同，但基本上反映了其特征。两种河岸过滤场景都产生了narG转录物与速率的正向但不均匀的关系，而nirS转录物表现出强烈的滞后行为。河岸蓄水场景与具有周期性氧浓度的河岸过滤场景相比，转录物浓度和反应速率的日平均值（图3g和3h）显示了两种明显不同的模式，对应两个脱氮区，类似于纯地下水补给和纯河岸过滤情景的模式。在这两个区域，关系是非线性和非均匀的，类似于所有其他情况。这在narG转录本中最为明显（如图3d所示）。
图4. 转录物（左）和酶（右）浓度与河岸过滤情景下反硝化率的关系，其中河水中的氧浓度波动，渗入地下水。
图4a和4c显示了具有波动氧气流入浓度的河岸过滤方案中转录物浓度和反硝化速率之间的关系。反应速率和转录物浓度都在一天中波动，但信号具有相移。这导致转录物浓度和反应速率之间关系的滞后，在不同位置具有不同的滞后模式。酶浓度和反硝化速率之间的关系（图4b和4d）也是高度非线性和位置特异性的。然而，它表现出不太明显的迟滞回线，因为与转录物相比，酶产生和衰变的特征时间比波动的时间尺度更长。因此，在具有昼夜循环的动态稳态中，酶浓度在全天几乎保持恒定，而反应速率响应于水性底物的周期性浓度变化而波动。
图5. 去除O2抑制、溶解有机碳（DOC）限制、氮底物限制或其组合后，功能基因转录物narG（上）和nirS（下）浓度与潜在反硝化速率之间的关系
出现与预期线性关系的偏差是因为反硝化速率不仅受到酶浓度的限制，还受到底物可用性和氧抑制的限制。本文将受底物可用性和氧抑制限制的原位条件下的反硝化速率称为有效速率。在模型中通过将速率除以相应的Michaelis-Menten或抑制项来消除这些限制，从而得到潜在反硝化速率。本文使用越来越多的限制项依次进行了分析，得出了一系列不同的潜在速率。当将这些潜在速率与转录物浓度进行比较时，出现了明确的正相关关系（图5）。
图6. 在具有波动氧气浓度的河岸过滤场景中nirS转录物浓度的模拟测量
在这样一个动态系统中，基于功能基因转录本的分析将强烈依赖于采样的时间点。转录本在某一特定时间表现出较低的，甚至无法检测到的丰度，可能在一天中的其他时间以更高的浓度出现。因此，基于零星采样获得的转录本浓度对整个系统行为的解释，在高度动态的生物地球化学环境中，例如在河流-地下水界面发现的环境中，可能会产生误导。模型模拟了不同时间和空间的转录本测量，以说明不同的采样频率和时间如何影响测量运动所捕获的结果。图6a显示了每天10个样本的高采样频率很好地捕获了日信号。每天取3个样本也可以捕获系统的动态行为，尽管准确性较低，许多峰值被截断。图6b显示了模拟测量转录本在一天中两个不同时间的空间分布。虽然两个剖面的大致形状相似，但峰值的位置移动了，两个时间点之间的浓度差异高达2个数量级。
第二部分：贡献解读
背景问题：现实环境中化学物质的反应速率很多与微生物直接关联。但许多测序研究以生物的分类学和多样性为目标，而没有提供有关反应速率的直接信息。元组学数据主要针对基因、转录物和蛋白质的相对丰度。这种半定量信息特别难以转换为速率表达式。而功能基因、其转录物和相应酶的定量测量直接关系到具有特定代谢途径的生物体的丰度及其活性。同时，测量分子生物学或组学标记物比测量反应速率变得更直接。然而活性数据如转录物、酶等能否直接与反应速率相关联仍然是值得思考的问题。由于分子生物学分析的高分析成本，在大尺度和高时间分辨率对环境微生物监测是很难的，因此利用合适的方法了解现实环境中微生物与反应速率的关系是十分重要的。
核心发现：模型强调了使用功能基因转录本和酶来表征河流-地下水界面生物地球化学反应的一些前景和局限性。功能基因转录本的浓度对底物浓度和氧水平的变化迅速作出反应，这意味着动态系统需要在适当的时间分辨率下采样。高转录物和酶浓度在空间上与反应活性过程一致，因此是反应区的定性指标。然而，酶的底物限制和氧抑制导致转录物或酶浓度与反应速率之间存在复杂的、非唯一的关系。因此，无法使用功能基因转录本和酶的浓度作为微生物反应速率的直接代理。
原文来源：Störiko, A., et al., Denitrification-Driven Transcription and Enzyme Production at the River-Groundwater Interface: Insights From Reactive-Transport Modeling, Water Resources Research, 2022, https://doi.org/10.1029/2021WR031584.
本文由中国地质大学（武汉）生物地质与环境地质国家重点实验室袁松虎教授课题组硕士生方文解读。受作者能力所限，本文难免有不当之处，敬请各位读者谅解。如疑义、建议或其他方面的学术交流，请与袁松虎教授联系，邮箱yuansonghu622@cug.edu.cn.
